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立体选择性酰胺酶的筛选、改造及其在L-草铵膦合成中的应用

论文目录
摘要第1-12页
ABSTRACT第12-13页
第一章 绪论第14-46页
    1.1 手性氨基酸概述第14-16页
        1.1.1 手性氨基酸第14页
        1.1.2 手性氨基酸的制备方法第14-16页
    1.2 草铵膦概述第16-28页
        1.2.1 草铵膦的生化功能第16-17页
        1.2.2 DL-草铵膦的化学合成法第17-20页
        1.2.3 L-草铵膦的化学合成第20-24页
        1.2.4 L-草铵膦的生物合成第24-28页
    1.3 酰胺酶第28-39页
        1.3.1 酰胺酶简介与分类第28-31页
        1.3.2 酰胺酶的底物特异性与立体选择性第31-36页
        1.3.3 酰胺酶的筛选第36-38页
        1.3.4 酰胺酶的克隆表达第38-39页
        1.3.5 酰胺酶的分子改造第39页
    1.4 枯草芽孢杆菌表达系统第39-43页
        1.4.1 枯草芽孢杆菌第39-40页
        1.4.2 影响枯草芽孢杆菌表达因素简介第40页
        1.4.3 启动子第40-42页
        1.4.4 信号肽第42-43页
    1.5 课题研究意义和主要研究内容第43-46页
        1.5.1 课题立项依据和研究意义第43页
        1.5.2 研究内容第43-46页
第二章 立体选择性酰胺酶的筛选第46-72页
    2.1 引言第46-47页
    2.2 材料与方法第47-55页
        2.2.1 主要实验试剂第47页
        2.2.2 菌种质粒及培养基第47页
        2.2.3 实验仪器与设备第47-48页
        2.2.4 高通量筛选方法的建立第48-50页
        2.2.5 立体选择性酰胺酶产生菌的筛选第50-51页
        2.2.6 产酶微生物菌株的鉴定第51-52页
        2.2.7 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与质粒的转化第52页
        2.2.8 立体选择性酰胺酶基因的挖掘第52页
        2.2.9 重组质粒构建第52-53页
        2.2.10 酰胺酶全基因合成第53-54页
        2.2.11 重组酰胺酶的表达与酰胺酶粗酶制备第54页
        2.2.12 核酸与蛋白电泳第54页
        2.2.13 酰胺酶催化底物转化成L-PPT的转化率与e.e.值测定第54页
        2.2.14 L-草铵膦的含量与e.e.值分析第54-55页
    2.3 结果与讨论第55-69页
        2.3.1 高通量筛选方法的建立与验证第55-60页
        2.3.2 酰胺酶产生菌的筛选与鉴定第60-63页
        2.3.3 酰胺酶基因的挖掘第63-66页
        2.3.4 产酰胺酶菌株中酰胺酶基因的克隆第66-67页
        2.3.5 重组酰胺酶基因的分泌表达第67-69页
    2.4 本章小结第69-72页
第三章 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达第72-90页
    3.1 引言第72-73页
    3.2 材料与方法第73-77页
        3.2.1 主要实验试剂第73页
        3.2.2 菌株试剂及培养基第73页
        3.2.3 实验仪器及设备第73页
        3.2.4 枯草芽孢杆菌基因组提取第73-74页
        3.2.5 枯草芽孢杆菌内源启动子与信号肽引物设计第74页
        3.2.6 含有不同启动子质粒的构建第74-76页
        3.2.7 单启动子的筛选与表征第76页
        3.2.8 双启动子构建第76页
        3.2.9 具备高效分泌效率的信号肽的筛选第76页
        3.2.10 枯草芽孢杆菌的扩大培养第76-77页
        3.2.11 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达第77页
    3.3 结果与分析第77-88页
        3.3.1 枯草芽孢杆菌内源启动子的筛选与表征第77-82页
        3.3.2 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌内源性启动子作用下的活力测定与表征第82-83页
        3.3.3 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌串联双启动子作用下的活力测定与表征第83-85页
        3.3.4 信号肽的筛选第85-86页
        3.3.5 Bm-Ami在5 L发酵罐中的扩大生产第86-87页
        3.3.6 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达第87-88页
    3.4 本章小结第88-90页
第四章 立体选择性酰胺酶的酶学性质分析第90-110页
    4.1 引言第90页
    4.2 材料与方法第90-95页
        4.2.1 主要实验试剂第90-91页
        4.2.2 菌种质粒及培养基第91页
        4.2.3 实验仪器与设备第91页
        4.2.4 立体选择性酰胺酶表达及纯化第91-92页
        4.2.5 重组酰胺酶酶活测定与蛋白含量测定第92页
        4.2.6 重组酰胺酶酶学性质的测定第92-93页
        4.2.7 酰胺酶动力学参数的测定第93页
        4.2.8 底物特异性第93-95页
    4.3 结果与分析第95-108页
        4.3.1 重组立体选择性酰胺酶的序列结构分析第95-97页
        4.3.2 重组立体选择性酰胺酶的系统发育分析第97-98页
        4.3.3 重组立体选择性酰胺酶的纯化第98-100页
        4.3.4 pH对酰胺酶酶活的影响及pH稳定性第100-102页
        4.3.5 温度对酰胺酶酶活的影响及温度稳定性第102-103页
        4.3.6 金属离子、特殊化学物质和有机溶剂对酶活的影响第103-104页
        4.3.7 动力学参数的测定第104页
        4.3.8 底物特异性第104-108页
    4.4 本章小结第108-110页
第五章 重组酰胺酶的分子改造第11-122页
    5.1 引言第110页
    5.2 材料与方法第110-114页
        5.2.1 主要实验试剂第110-111页
        5.2.2 菌株、质粒及培养基第111页
        5.2.3 实验仪器与设备第111页
        5.2.4 酰胺酶Bm-Ami的同源建模第111页
        5.2.5 酰胺酶模型YBm-Ami的活性口袋预测及分析第111页
        5.2.6 酰胺酶突变文库的构建与筛选第111-113页
        5.2.7 酰胺酶突变体动力学参数的测定第113页
        5.2.8 酰胺酶突变体的分子对接分析第113-114页
    5.3 结果与讨论第114-120页
        5.3.1 酰胺酶同源建模及活性口袋预测及分析第114-115页
        5.3.2 酰胺酶突变文库的建立及筛选第115-116页
        5.3.3 组合突变和最优突变株的确立第116页
        5.3.4 动力学参数测定第116-117页
        5.3.5 酰胺酶突变体的分子对接分析第117-120页
    5.4 本章小结第120-122页
第六章 立体选择性酰胺酶在L-草铵膦合成中的应用第122-132页
    6.1 引言第122-123页
    6.2 材料与方法第123-125页
        6.2.1 主要实验试剂第123页
        6.2.2 菌株、质粒及培养基第123页
        6.2.3 实验仪器及设备第123页
        6.2.4 生物催化剂的制备第123页
        6.2.5 底物rac-4-[羟基(甲基)膦酰基]-2-(2-苯乙酰基)-丁酸(rac-S)的合成第123页
        6.2.6 立体选择性酰胺酶催化底物合成L-草铵膦的条件研究第123-124页
        6.2.7 不同底物浓度的反应进程研究第124页
        6.2.8 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦第124页
        6.2.9 L-草铵膦的分离纯化第124-125页
    6.3 结果与讨论第125-130页
        6.3.1 Rac-S的合成第125页
        6.3.2 酰胺酶的制备第125页
        6.3.3 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的条件优化第125-127页
        6.3.4 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的反应进程研究第127-128页
        6.3.5 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦第128-129页
        6.3.6 L-草铵膦的分离纯化及D型底物的消旋化第129页
        6.3.7 L-草铵膦的表征第129-130页
    6.4 本章小结第130-132页
第七章 结论与展望第132-136页
    7.1 结论第132-134页
    7.2 主要贡献与创新第134页
    7.3 展望第134-136页
参考文献第136-154页
附录第154-184页
致谢第184-186页
作者简介第186-188页
    1 作者简历第186页
    2 攻读博士学位期间发表的学术论文第186-187页
    3 参与的科研项目情况第187页
    4 发明专利第187-188页
学位论文数据集第188页

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